恭喜我司合作客戶成功發(fā)布關(guān)于RNA甲基化因子研究的文獻(xiàn)

標(biāo)題：《RNA甲基化因子對腎透明細(xì)胞癌預(yù)后價(jià)值的探討和驗(yàn)證》

摘要：【目的】腎透明細(xì)胞癌(clear cell Renal Cell Carcinoma ccRCC)是高發(fā)的一類惡性腫瘤,罹患率和死亡率居高不下,因此研究ccRCC的致病機(jī)制,尋找新的分子治療靶向位點(diǎn)是十分必要的。RNA甲基化是重要的轉(zhuǎn)錄后修飾方法,既往研究已發(fā)現(xiàn)多個RNA甲基化調(diào)節(jié)因子與惡性腫瘤密切相關(guān),但全面探討RNA甲基化因子對ccRCC臨床病理影響的報(bào)道相對較少,因此本課題應(yīng)用生物信息學(xué)分析開展RNA甲基化調(diào)控因子與ccRCC關(guān)系的研究,進(jìn)而用細(xì)胞和組織實(shí)驗(yàn)對生信結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證?！痉椒ā?、從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫的ccRCC全基因表達(dá)譜中提取48個RNA甲基化調(diào)控因子的表達(dá)隊(duì)列,從中篩選差異表達(dá)基因;對差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋;利用單因素cox分析篩選與ccRCC預(yù)后相關(guān)的差異表達(dá)基因。2、用R包“Consensus Cluster Plus"對預(yù)后相關(guān)的差異表達(dá)基因進(jìn)行無監(jiān)督聚類分型,分析不同分型ccRCC的預(yù)后情況,在分型中進(jìn)行富集分析,比較不同分型中免疫微環(huán)境的差異。3、用“glmnet"包中的Lasso cox方法,基于有預(yù)后價(jià)值的RNA甲基化因子構(gòu)建ccRCC的風(fēng)險(xiǎn)評分模型,結(jié)合風(fēng)險(xiǎn)評分建立列線圖以量化風(fēng)險(xiǎn)評分的預(yù)后能力。4、結(jié)合多因素cox分析和文獻(xiàn)檢索篩選出進(jìn)一步分析的一個關(guān)鍵因子。5、利用RNA定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)實(shí)驗(yàn)和Western Blot(蛋白質(zhì)印跡法)檢測ccRCC細(xì)胞株中關(guān)鍵因子的mRNA和蛋白表達(dá)情況。6、利用RT-qPCR實(shí)驗(yàn)分析目的基因在新鮮ccRCC組織和癌旁腎組織中的mRNA表達(dá)情況。7、隨機(jī)選取ccRCC石蠟組織進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn),明確目的蛋白在癌和正常組織中的表達(dá)模式。選取我院2014年-2018年經(jīng)病理科確診的80例ccRCC石蠟標(biāo)本,進(jìn)行關(guān)鍵因子的石蠟組織免疫組化實(shí)驗(yàn),比較目的蛋白在癌組織和正常腎組織中的表達(dá)差異。8、聯(lián)合80例ccRCC石蠟組織中目的蛋白的免疫組化結(jié)果和腫瘤發(fā)病部位、腫瘤直徑、性別、年齡、有無脈管內(nèi)癌栓、腫瘤ISUP分級、腫瘤分期、Ki-67指數(shù)等臨床病理參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析;探究目的蛋白對ccRCC生存預(yù)后的影響,結(jié)合臨床病理參數(shù)進(jìn)行單因素和多因素cox分析,最后聯(lián)合臨床參數(shù)構(gòu)建預(yù)后列線圖模型?！窘Y(jié)果】1、納入的48個RNA甲基化調(diào)節(jié)因子在ccRCC中有39個呈現(xiàn)表達(dá)差異,其中24個基因表達(dá)上調(diào),15個基因表達(dá)下調(diào)。差異表達(dá)基因的功能注釋結(jié)果顯示它們與各類RNA的甲基化修飾和物質(zhì)代謝有關(guān)。2、39個差異表達(dá)基因的單因素cox分析顯示有12個因子與ccRCC的預(yù)后有關(guān)(P<0.05),以這些因子的表達(dá)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),可以將TCGA數(shù)據(jù)庫中的ccRCC患者聚類為1和2兩種分子類型?？?Kaplan-Meier,K-M)生存分析顯示2型患者的生存預(yù)后明顯差于1型患者;富集分析結(jié)果顯示2型分子分型主要與物質(zhì)代謝有關(guān),2型患者的免疫評分明顯高于1型(P<0.05),2型中CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、髓源性抑制細(xì)胞(myeloid derived suppressor cells,MDSC),單核細(xì)胞等免疫細(xì)胞的浸潤程度明顯高于1型(P<0.01)。3、將12個預(yù)后因子納入Lasso cox中分析,獲得一個7基因風(fēng)險(xiǎn)評分模型:Risk Score=0.571*NOP2+0.393*NSUN6-0.313*TRMT61B-0.049*ALKBH1+0.185*NSUN5-0.343*TET2+0.02 6*DNMT3B。7個基因中,4個為危險(xiǎn)因子(NOP2、NSUN6、NSUN5、DNMT3B),與ccRCC的不良預(yù)后有關(guān);3個為保護(hù)因子(TET2、TRMT61B、ALKBH1),與相對好的預(yù)后有關(guān)。利用風(fēng)險(xiǎn)評分進(jìn)行分組,然后進(jìn)行K-M分析,低評分組患者的生存時(shí)間明顯長于高評分組患者(P<0.001);單因素和多因素cox分析結(jié)果顯示:風(fēng)險(xiǎn)評分、年齡、分期和分級是ccRCC的獨(dú)立預(yù)后因素(P<0.05)。利用這些獨(dú)立預(yù)后因子,構(gòu)建出一個預(yù)測ccRCC 1年、3年和5年生存率的列線圖。4、基于多因素cox分析和文獻(xiàn)檢索將風(fēng)險(xiǎn)評分模型中的構(gòu)成因子NOP2確定為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的關(guān)鍵基因。5、ccRCC細(xì)胞株中NOP2 mRNA(P=0.0271)和蛋白質(zhì)(P=0.0129)的相對表達(dá)量均高于正常腎小管上皮細(xì)胞株。6、NOP2 mRNA在ccRCC新鮮組織(P=0.0082)中較正常腎組織顯著上調(diào)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示NOP2蛋白在ccRCC中的表達(dá)模式主要為核陽性染色,在正常腎組織中的表達(dá)模式主要為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜陽性染色,而少見核陽性表達(dá)。免疫組化中NOP2蛋白的表達(dá)模式和定位與免疫熒光相同。結(jié)合文獻(xiàn)以核陽性率作為NOP2蛋白表達(dá)情況的評價(jià)指標(biāo),ccRCC組織中的NOP2核陽性率為42.9±15.7%,癌旁腎組織中的核陽性率為14.1±13.5%,統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明ccRCC癌組織中的NOP2蛋白表達(dá)量明顯高于正常腎組織(P<0.001)。7、以核陽性率的中位數(shù)43.67%作為截?cái)嘀祵⒒颊叻譃镹OP2蛋白高表達(dá)組和NOP2蛋白低表達(dá)組,統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示高NOP2蛋白表達(dá)組與ccRCC高腫瘤分級(3級和4級,P<0.001)和高Ki-67指數(shù)(P=0.0035)有關(guān),但年齡、腫瘤部位、腫瘤直徑、腫瘤分期、有無癌栓和性別等參數(shù)在不同NOP2蛋白表達(dá)組間未獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。8、NOP2蛋白表達(dá)與ccRCC患者的總生存時(shí)間(Overall Survival,OS,P=0.0015)和無進(jìn)展生存時(shí)間有關(guān)(Progression-Free Survival,PFS,P<0.001),NOP2蛋白表達(dá)高表達(dá)組的OS和PFS差于低表達(dá)組。對NOP2蛋白表達(dá)及其它臨床病理參數(shù)進(jìn)行單因素和多因素cox分析,在單因素分析中NOP2蛋白表達(dá)(P=0.0072)和腫瘤分級(P=0.015)與患者的OS相關(guān);多因素cox分析中NOP2蛋白表達(dá)(P=0.041)與患者OS有關(guān),是ccRCC的獨(dú)立預(yù)后因素。最后以NOP2蛋白表達(dá)等參數(shù)為基礎(chǔ),可以構(gòu)建預(yù)測ccRCC患者生存率的列線圖模型。【結(jié)論】1、ccRCC中存在多個差異表達(dá)的RNA甲基化調(diào)控因子,且與該病的預(yù)后相關(guān)。2、基于預(yù)后相關(guān)的RNA甲基化調(diào)控差異表達(dá)因子可以將ccRCC患者分為1型和2型,2型患者的預(yù)后差于1型,這種差異形成的原因可能與2型患者中代謝功能紊亂引起的免疫抑制有關(guān)。3、通過機(jī)器學(xué)習(xí)模型構(gòu)建的7基因風(fēng)險(xiǎn)評分模型對ccRCC有較強(qiáng)的預(yù)后評估能力,并且風(fēng)險(xiǎn)評分、年齡、分期、分級是ccRCC的獨(dú)立預(yù)后因素,這些因素聯(lián)合建立的列線圖可以實(shí)現(xiàn)預(yù)后能力的量化。4、RNA甲基化調(diào)節(jié)關(guān)鍵因子NOP2的mRNA和蛋白表達(dá)在ccRCC組織和細(xì)胞系中均顯著上調(diào),并且NOP2mRNA和蛋白的高表達(dá)均與ccRCC患者的不良預(yù)后有關(guān)。5、NOP2蛋白表達(dá)是ccRCC的獨(dú)立預(yù)后因素,可能參與該腫瘤的疾病進(jìn)展,在ccRCC中發(fā)揮促癌作用。