恭喜我司合作客戶成功發(fā)布關(guān)于急性病毒性心肌炎的文獻

標(biāo)題：《急性病毒性心肌炎小鼠模型中l(wèi)ncRNAs的表達譜分析及l(fā)ncGBP9作用機制的初步研究》

摘要：背景及目的:柯薩奇B3病毒(coxsackievirus B3,CVB3)是導(dǎo)致急性病毒性心肌炎(acute viral myocarditis,AVMC)的主要病原體,可導(dǎo)致暴發(fā)性心肌炎、惡性心律失常或心臟驟停,其致病機制主要涉及病毒的直接感染、自身免疫反應(yīng)和代謝紊亂等。隨著技術(shù)的進步,現(xiàn)在可以更快更準(zhǔn)確地診斷AVMC,但AVMC的治療仍主要局限于抗病毒、免疫調(diào)節(jié)及循環(huán)支持治療。因此,迫切需要提升我們對AVMC發(fā)生發(fā)展機制的理解,這可能為開發(fā)新的治療方法提供線索。 長鏈非編碼RNAs(long noncodingRNAs,lncRNAs)是一類長度超過200個核苷酸且缺乏蛋白質(zhì)編碼能力的轉(zhuǎn)錄本,其重要的調(diào)控功能正受到研究工作者的廣泛關(guān)注。近10年來,越來越多的證據(jù)表明lncRNAs在不同的細(xì)胞過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用,如細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖、炎癥和凋亡等。LncRNAs在各種心血管疾病中的關(guān)鍵作用也被逐步挖掘,然而很少有研究探討lncRNAs在AVMC中的表達及作用機制。 鑒于此,本課題組首次應(yīng)用高通量測序分析AVMC小鼠心肌組織中l(wèi)ncRNAs的差異表達譜,并進行生物信息學(xué)研究。另外,我們推測lncRNA鳥苷酸結(jié)合蛋白9(lncRNA guanylate-binding protein 9,lncGBP9)在AVMC中可能發(fā)揮重要作用,從體內(nèi)和體外層面評估lncGBP9在AVMC中的生物學(xué)功能,并進一步探討其潛在機制。本研究從一個嶄新的角度理解AVMC的致病機制,為今后尋找可能的治療靶點提供新思路。 方法: 1.基于高通量測序的AVMC小鼠心肌組織中l(wèi)ncRNAs的表達譜分析及生物信息學(xué)研究:首先通過腹腔注射CVB3構(gòu)建AVMC小鼠模型,選擇5對心肌組織樣本(Control組和AVMC組各5個)進行高通量測序,對比分析lncRNAs和信使RNAs(messengerRNAs,mRNAs)的特征,篩選出差異表達的lncRNAs(differentially expressed lncRNAs,DElncRNAs)和mRNAs(differentially expressed mRNAs,DEmRNAs),并進行GO分析及KEGG分析。接著,應(yīng)用RT-qPCR驗證測序結(jié)果的可靠性。最后,通過構(gòu)建DElncRNAs和DEmRNAs的共表達網(wǎng)絡(luò)進一步研究DElncRNAs在AVMC中的調(diào)控機制。 2.LncGBP9在小鼠AVMC中的作用及機制研究:選擇明顯高表達的lncGBP9進行研究。MEM及l(fā)ncLocator網(wǎng)站預(yù)測lncGBP9的作用、富集通路及定位,RT-qPCR檢測其在AVMC小鼠心肌組織中的表達情況,FISH分析其亞細(xì)胞定位。構(gòu)建敲低lncGBP9的重組9型腺相關(guān)病毒載體,利用心臟超聲、心肌冰凍切片、HE染色、TUNEL染色、RT-qPCR及WB等方法研究敲低lncGBP9對AVMC小鼠心功能、心肌炎癥及凋亡的影響。RT-qPCR及ELISA檢測促炎細(xì)胞因子(TNF-α,IL-6,IL-1β)的表達,并分析敲低lncGBP9對NF-κB信號通路的調(diào)控作用。 3.LncGBP9在感染CVB3的HL-1心肌細(xì)胞中的作用及機制研究:體外培養(yǎng)HL-1心肌細(xì)胞,利用敲低lncGBP9的慢病毒載體,構(gòu)建穩(wěn)定敲低lncGBP9的HL-1細(xì)胞株。通過CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)、RT-qPCR、WB、ELISA等方法評估lncGBP9敲低對感染CVB3的HL-1細(xì)胞的存活力、炎癥及凋亡的影響。最后,WB實驗進一步檢測NF-κB信號通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平。 結(jié)果: 1.成功構(gòu)建AVMC小鼠模型,測序結(jié)果分析顯示,與mRNAs對比,lncRNAs的轉(zhuǎn)錄本和開放閱讀框的長度較短,且具有較少的外顯子數(shù)量。以padj<0.05和|log2Fold Change|>1為閾值,共篩選出1122個DElncRNAs和3186個DEmRNAs,包括734個上調(diào)和388個下調(diào)的lncRNAs、1821個上調(diào)和1365個下調(diào)的mRNAs。GO和KEGG分析顯示上調(diào)的mRNAs主要參與免疫相關(guān)過程,下調(diào)的mRNAs主要參與代謝相關(guān)過程,DElncRNAs的共定位和共表達基因也主要參與代謝及免疫相關(guān)過程。RT-qPCR分析驗證了隨機選取的12個基因(6個DElncRNAs和6個DEmRNAs)的表達水平與測序中的表達水平一致,反映了測序結(jié)果的可靠性。最后,使用Cytoscape構(gòu)建在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用通路、MAPK信號通路及PI3K-Akt信號通路中DElncRNAs和DEmRNAs的共表達網(wǎng)絡(luò)(|PCC|>0.99),分別包含了65個DElncRNAs與38個DEmRNAs、21個DElncRNAs與16個DEmRNAs及31個DElncRNAs與17個DEmRNAs。 2.MEM網(wǎng)站預(yù)測結(jié)果顯示,lncGBP9的共表達基因在“Viral myocarditis"和“NF-κB signaling pathway"均顯著富集;lncLocator網(wǎng)站預(yù)測其可能主要富集于細(xì)胞質(zhì)中。RT-qPCR及FISH實驗證實其在AVMC小鼠心肌組織中的明顯高表達并且主要定位于細(xì)胞質(zhì)。敲低lncGBP9有助于減輕AVMC小鼠的心肌炎癥及凋亡,進而改善心功能。此外,敲低lncGBP9還可以抑制NF-κB信號通路激活,從而減少體內(nèi)促炎細(xì)胞因子(TNF-α,IL-6,IL-1β)的產(chǎn)生。 3.RT-qPCR證實lncGBP9在感染CVB3的HL-1心肌細(xì)胞中明顯高表達。敲低lncGBP9可以通過調(diào)控NF-κB信號通路提升感染CVB3的HL-1細(xì)胞的存活力、抑制細(xì)胞凋亡、減少促炎細(xì)胞因子(TNF-α,IL-6,IL-1β)的釋放。 結(jié)論: 1.本研究鑒定了AVMC小鼠心肌組織中l(wèi)ncRNAs和mRNAs的差異表達譜。生物信息學(xué)研究表明,這些DElncRNAs、DEmRNAs及其相互作用可能在AVMC發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用,為闡明AVMC的致病機制提供了寶貴的信息。值得注意的是,我們證實部分DElncRNAs參與了細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、MAPK信號通路和PI3K-Akt信號通路的調(diào)控,未來值得進一步深入研究。 2.本研究還揭示了敲低lncGBP9對CVB3誘導(dǎo)的AVMC的保護作用,其可通過減輕心肌的炎癥損傷和細(xì)胞凋亡,從而改善心功能,這可能部分歸因于NF-κB信號通路的抑制,進而減少相關(guān)促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生。因此,lncGBP9可能是AVMC治療的一種新的、潛在的靶點。